高效液相色谱法在氨基酸、多肽和蛋白质方面的分析研究

发布日期:2019-05-23 10:41 字号:

   当前随着生命科学和生物工程技术的迅速发展,人们对氨基酸、多肽、蛋白质及核碱、核苷、核苷酸、核酸(核糖核酸RNA、脱氧核糖核酸(DNA)等生物分子的研究兴趣日益增加。这些生物活性分子是人类生命延续过程必须摄取的成分,也是生物化学、生化制药、生物工程中进行蛋白质纯化、DNA重组与修复、RNA转录等技术中的重要研究对象,因此涉及它们的分离、分析问题也日益重要。
    高效液相色谱法中的反相色谱法、体积排阻色谱法、亲和色谱法和离子色谱法都可用于上述多种生物分子的分离和分析。
 蛋白质是一切生物体的主要组成成分,也是生物体形态结构和生命活动所依赖的物质基础。蛋白质是由多肽链构成的,而多肽又是由氨基酸组成的,因此在生命科学研究中,对氨基酸、多肽、蛋白质的分析研究始终是一个热门课题。
   (一)氨基酸
   氨基酸(amino acid)样品主要来自两个方面,一是由动物或植物蛋白质水解产生,另一是存在于生物体的血浆或体液中。
    由摩尔(Moore S.)等人提出用离子交换法分离氨基酸,并发展成氨基酸自动分析仪。此法利用经硫化的阳离子交换柱,可分离 20 多种氨基酸,再经柱后与茚三酮反应,在可见光范围(570nm)测定吸光度,从而完成检测和定量测定。此法使用的树脂粒度已由40μm 减小至(6μm,分析时间由几小时减少为约1h,此技术已经日趋完善。
    采用高效液相色谱进行氨基酸的分析也已进行了大量的研究工作,由于仅有少数氨基酸,如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、脯氨酸、组氨酸具有紫外吸收性质,可用紫外吸收检测器测定外,其他氨基酸皆需在柱前或柱后衍生后,使用紫外吸收或荧光检测器进行测定。
    当用反相键合相柱分离氨基酸时,由于氨基酸的等电点、极性和分子大小不同,组分洗脱顺序也不相同,通常遵循下述规律:
    ①通常呈酸性和带羟基的氨基酸先洗脱下来,然后是中性氨基酸,最后是碱性氨基酸。
    ②在同类型氨基酸中,短碳链的小分子先洗脱下来,长碳链的大分子后洗脱下来。如甘氨酸(Gly)先于丙氨酸(Ala)流出,缬氨酸(Val)先于亮氨酸(Leu)流出。
    ③对碳数相同的氨基酸,有支链的先流出,无支链的后流出。如异亮氨酸(4,2)先于亮氨酸(Leu)流出。
    ④碳链上存在羟基可加速洗脱。如丝氨酸(Ser)先于丙氨酸(Ala)流出,酪氨酸(Tyr)先于苯丙氨酸(Phe)流出。
    常用的氨基酸柱前衍生化试剂如表(6-4-1) 所示。
 
表6-4-1  氨基酸柱前衍生化试剂
 
       
表6-4-2  PTIC - 氨基酸衍生物色谱分离的佳梯度洗脱程序
 
表6-4-3  AQC - 氨基酸衍生物色谱分离的梯度洗脱程序
 
 
    氨基酸混合物经与荧光衍生试剂Phisyl - Cl 柱前衍生后,用反相键合相柱分离后的谱图如图6-4-3所示。
表6-4-4  Phisyl-Cl- 氨基酸衍生物色谱分离的梯度洗脱程序
 
    除了使用柱前衍生化法(或柱后衍生化法)测定氨基酸含量外,还可使用间接光度法测定,即预先向流动相中加入具有紫外吸收的试剂(如α- 萘胺、3,4 - 二甲基苯胺等),当有脂肪族氨基酸流出色谱柱时,利用紫外吸收强度的降低实现对氨基酸的测定。
    (二)多肽
    由一个氨基酸的α-羧基与另一个氨基酸的α-氨基,经脱水缩合生成的化合物叫肽。由两个氨基酸缩合形成的叫二肽,由多个氨基酸缩合形成的叫多肽(Peptides)。其分子量达10^2-10^4。
    在多肽分离中,当固定相确定后,常使用具有一定 pH 值的缓冲溶液(如磷酸盐、甲酸盐缓冲溶液)作流动相,且向缓冲溶液中加入盐(如NaCl),保持一定的盐浓度可减小峰形扩散,改善分离度。向流动相中加入改性剂,可改善色谱分离的选择性。
    由于肽键在紫外光200-220nm具有光吸收特性,因此对大多数肽的分离,都可使用UVD在此波长范围内进行测定。若多肽的肽链中含有可吸收紫外光的酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸时,可直接用254nm 检测,当检测灵敏度低时,也可使用邻苯二甲醛(OPA)、氯甲酸芴甲酯(FMOC)等,先进行柱前衍生,然后用荧光检测器检测,对OPA - 氨基酸衍生物λex=330nm,λem=450nm;对FMOC - 氨基酸衍生物λex=263nm,λex=313nm。
    图6-4-4 为氨基酸和小肽(2-5 肽)在反相键合相柱上的分离谱图。
 
    
    色谱柱Lichrosorb RP - 18 (5μm,φ4.6nm*25cm)流动相从0.6mol/L HClO4(pH=0.2)经50min 凹形梯度洗脱至100%乙腈(体积);流量2mL/min;柱温70℃,柱压15.2MPa;进样10pμL(每个组分含量约为1μg)。用UVD(200nm)检测,实现了29 个组分的分离。
    图6-4-5为多肽和氨基酸在正相硅胶色谱柱上的分离谱图。色谱柱Lichrosorb Si 60(7μm,φ4.8nm*150cm);流动相 (A)90% 乙腈水溶液,含0.1mol/L NH4OH 和1μg/L 铜盐(Ⅱ);(B)40%乙腈水溶液,含0.95mol/L NH4OH 和 1μg/L 铜盐(Ⅱ);流量2mL/min(在75min内完成一个梯度洗脱周期);进样量30μL。在上述经用流动相铜盐(Ⅱ)改性的硅胶柱上,作为Cu2+络合物的多肽和氨基酸获得分离。此图中在0-15in 洗脱出的是疏水多肽(大肽),如苯丙+ 苯丙肽(*$Q + *$Q)和丙氨+ 丙氨+ 丙氨肽(Ala-Ala-Ala);在15-47min 为10 种主要的二肽;在47-75min 为氨基酸、亲水多肽和由基本氨基酸构成的基肽,如丝氨+ 丝氨+ 丝氨肽(Ser-Ser-Ser)和甘氨+ 甘氨+ 甘氨肽(Glt-Gly-Gly)。
     
   (三)蛋白质
    蛋白质(protein)是由几十到几千个氨基酸分子借助肽键和二硫键相互连接的多肽链,随肽链数目、氨基酸组成及排列顺序的不同,蛋白质分子呈现三维空间结构,可为弯曲链状或因形成α- 螺旋、β- 折叠、β- 折角卷曲而近似呈球状结构,分子量达10^4-10$6,并具有生物活性。
    作为生物大分子的蛋白质,不仅分子量大,而且,它们在溶液中的扩散系数比较小、粘度大,易受外界温度、pH、有机溶剂的影响而发生变性,并引起结构改变。生物大分子的上述特性使它们的色谱分离行为远离理想情况,对实现它们的HPLC分离带来了实际困难。因此解决它们的分离和分析问题至今仍是具有挑战性的课题。
    对一般蛋白质分子,其分子内有由疏水侧链组成的疏水核心,在其表面上分布有许多亲水基团,形成表面亲水区,这就是蛋白质分子的结构特点。进行蛋白质分离时,可使用体积排阻色谱法、离子交换色谱法、反相键合相色谱法和亲和色谱法。当使用反相HPLC时应考虑蛋白质变性问题,蛋白质分子接触到有机溶剂或吸附在反相固定相时,会引起变性,并丧失生物活性,若使用中等极性反相键合柱,以磷酸盐的异丙醇 - 水体系为流动相,保持pH=3-7 范围,许多蛋白质经反相HPLC分离后,仍能保持生物活性。
    图6-4-6为在球形薄壳型和全多孔型反相键合相上,五种蛋白质的分离谱图。色谱柱柱(1)Hy-Tach C18 球形薄壳型固定相(2μm,φ4.6mm*30mm);柱(2)Vydac C18全多孔型固定相(2μm,孔径30nm,φ4.6mm*30mm)。
    流动相(A)10% 三氟乙酸水溶液;(B)含0.1% 三氟乙酸的95%乙腈水溶液。使用UVD(210NM)检测,流动相的梯度洗脱程序如下:
        
    对柱(1),在3min 内使流动相中B 组分含量由15%增加至90%,流量为1.3mL/min;
    对柱(2),在9min 内使流动相中B 组分含量由15%增加至90%,流速为2.0mL/min。
    当使用灌注色谱固定相POROS R/M 时,可分别在低流速和高流速下实现不同蛋白质的完全分离(图6-4-7)。色谱柱为POROS R/M,10μm,300A,φ4.6mm*100mm;流动相(A)0.1%三氯乙酸(T)FA水溶液+5%乙腈水溶液;(B)100%乙腈。梯度洗脱程序如下:
        
        
   
    
    线性梯度洗脱程序:对(1)、(2)柱在$%9N: 内,流动相中乙腈由20%增至68%;对(3)、(4)柱,在15min 内,流动相中乙腈由20%增至68%。
    通过对图中各色谱柱对蛋白质分离情况的比较(分离度R和分离因子α)可知,具有小粒度的(1)柱和(2)柱具有更高的分离度,并且非多孔薄壳型的(2)柱还具有短的分离时间。
    由图6-4-6(a),图6-4-8(b)和图6-4-10(b)都可看到使用2-3μm 的薄壳型固定相可实现蛋白质的高效、快速分离。这是由于薄壳型固定相不存在溶质在颗粒内部孔隙的质量传递,溶质仅在固定相表面有短的扩散路程,因此对具有低扩散性的生物大分子(蛋白质、寡聚核苷酸、RNA、DNA),可实现快速的质量传递,从而缩短滞留时间,并利于保持生物大分子高的生物活性和回收率。

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