高效液相色谱法在核碱、核苷、核苷酸和核酸方面的分析研究

发布日期:2019-05-23 10:43 字号:

当前随着生命科学和生物工程技术的迅速发展,人们对氨基酸、多肽、蛋白质及核碱、核苷、核苷酸、核酸(核糖核酸RNA、脱氧核糖核酸(DNA)等生物分子的研究兴趣日益增加。这些生物活性分子是人类生命延续过程必须摄取的成分,也是生物化学、生化制药、生物工程中进行蛋白质纯化、DNA重组与修复、RNA转录等技术中的重要研究对象,因此涉及它们的分离、分析问题也日益重要。
    高效液相色谱法中的反相色谱法、体积排阻色谱法、亲和色谱法和离子色谱法都可用于上述多种生物分子的分离和分析。
核酸系指核糖核酸(ribonucleic,RNA)和脱氧核糖核酸(dexyribonucleic acid.DNA),它们是构成生物体细胞组织的主要成分。
    任何生物体细胞都具有发育成完整生物的全套遗传信息,DNA是遗传信息的主要载体;在生命延续过程,RNA在蛋白质的生物合成过程起着重要的作用。
    核酸是由多种核苷酸组合构成的,核苷酸是由多种核苷和磷酸组成的,核苷是由多种核碱和戊糖(核糖或脱氧核糖)组成的,核碱是组成核酸的基本成分。
    由RNA、DNA在生命科学研究中的重要地位,可预见到对核碱、核苷、核苷酸和核酸的分析
    图6-4-12 为在μ-Bondapak C18( 10μm,φ4mm*300mm)上分离核苷和核碱的谱图,室温使用UVD(254NM)检测,流动相为(A)0.010mol/L KH2PO4,pH=5.5(低洗脱强度);(B)80%的甲醇水溶液(高洗脱强度)。
    线性梯度洗脱程序为在30min 内,使流动相中甲醇含量由0%至25%。流动相流量为1mL/min。
    使用由高交联度苯乙烯和二乙烯基苯共聚制得的,刚性大孔共聚物PRP-1 固定相,分离核苷与核碱,其分离谱图相似于C18键合固定相,但使用流动相的pH值范围可扩展至1-13。
    当使用3μm全多孔ODS固定相分离核苷和核碱时,可获得更高的柱效和分离度。此时使用恒定组成溶剂洗脱可获得与梯度洗脱相近的分离效果(图6-4-13)。
    核碱和核苷也可用离子交换色谱法、反相离子对色谱法、染料配位亲和色谱法、电荷转移亲和色谱法进行分离。
    (二)核苷酸
    核苷酸(nucleotide)是核苷的磷酸酯,由其所含磷酸根数目的不同,可分为一磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯。核碱、核苷与核苷酸的关系如表6-4-5 所示。
      
表6-4-5  核碱、核苷和核苷酸组成的对应关系
 
    使用反相键合相μ-Bondapak C18柱分离核苷酸及核苷的谱图如图6-4-14 所示。固定
表6-4-6  在PA-1 柱上核苷酸分离的梯度程序
 
       
    核苷酸的分离同样可用生物特效亲和色谱、定位金属离子亲和色谱、电荷转移亲和色谱等方法予以实现。
   (三)寡聚核苷酸、核酸及其碎片
            

表6-4-7  核酸的组成

         

           

    在2.5μm 非多孔球形亲水树脂上,化学键合二乙氨基乙基官能团的离子交换TAKgel DEAE-NPR柱(φ4.6mm*35mm)上,使用UVD(260nm),可实现多种DNA水解液中限制性碎片(restrition fragments)的分析。
    图6-4-22为在TAKgel DEAE-NPR柱上分析pBR322 DNA-Hae Ⅲ水解液的谱图。流动相为在0.02mol/L Tris -HCl 缓冲溶液(pH=9.0),并进行如下述的线性梯度洗脱程序使流动相中NaCl浓度按表6-4-8增加。流动相流量为1.5mL/min。

表6-4-8  在TSKgel DEAE - NPR 柱分离DNA碎片的梯度程序
 
    反相键合相色谱作为检测DNA合成的有效手段,已用于分析人工合成DNA碎片的组成。如首先经DNA自动合成仪合成单链的寡聚核着酸d22(组成为5’-A GTTGAGGGGACTTTCCCAGGC - 3'和d24(组成为5’-TTGCTGGGAAAGTCCCCTCAACT - 3'),d24 经S - 三苯甲基 - 6 - 羊巟己基- 1 -(氰乙基二异丙氨基)亚磷酸盐改性,制成 S - 三苯甲基羊巟已基寡聚核苷酸d24(简化表示为tr - d24)。d24 也可经5’- 羊巟基己基改性制成5' -  羊巟基己基寡聚核苷酸d24(简化表示为HS - d24)。然后将d22 与等量HS- d24(或tr-d24)在45min溶液中进行退火处理,首先将溶液加热到85℃保持5min,随后降温至45℃保持45min,再冷却至室温。这两种单链寡聚核着酸经杂化生成双链DNA(表示为DSDNA)。上述反应后溶液经反相色谱分析结果如图6-4-23所示。
     
    图6-4-23为在YMCC18柱(5μm,φ4.6mm*150mm)上进行的分析。使用UVD(260nm)检测,流动相(A)0.01mol/L NaPO4,pH=6.9;(B)甲醇。
    在图6-4-23(a)中的梯度洗脱程序为在,46>? 内使流动相中B 的含量由O升至/100%,流量0.5mL/min。在图6-4--23(b)中梯度洗脱程序为在30min 内,使流动相中B 的含量由0 升至5O%。

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