液相色谱仪检测饲料中18种氨基酸(GB/T 17817-2010、GB/T 17818-2010、GB/T 17812-2008)

发布日期:2020-03-23 09:07 字号:


氨基酸对动物的生长、神经系统的发育及动物体内营养物质的正常代谢都有重要的作用,而且蛋白质是动物生长必需的营养物质,是评价饲料营养成分的一种重要物质,而氨基酸是构成蛋白质的基本单位,所以氨基酸的种类和含量也就是评价饲料质量的根本依据,从而准确检测氨基酸的含量和种类具有重要意义。柱后衍生的方法,虽然准确性高,但是耗时长、灵敏度低,所以本文采用柱前衍生的方法以缩短分析时间,增加灵敏度。同时该方法得到的氨基酸衍生物在-20℃可保存数月,克服了柱前衍生法衍生物不稳定的缺点,另外该方法准确性高,用标准品做未知样品进行检测,检测的含量与标准品的标示值非常接近。
参考标准:
(GB/T 17817-2010、GB/T 17818-2010、GB/T 17812-2008)饲料中 18种氨基酸的测定(柱前衍生HPLC法)

(1) 样品前处理

酸水解法:准确称取一定量的样品,使样品氨基酸总量在50~75mg范围内,置于20~30mL安瓿瓶中,加入10mL含0.1%苯酚的6mol/L盐酸,振摇使样品溶解或者是样品均匀分散在溶液中,将安瓿瓶置于-20℃冰箱中冷冻3~5分钟,充氮后用喷灯熔封,然后置于110±1℃烘箱中水解24小时,取出冷却,取水溶液1mL,置于浓缩管中用浓缩仪浓缩至干,加入1mL的0.1mol/L稀盐酸溶解,用0.45μm滤器过滤后,取清液贮存于冰箱中,供衍生使用。

(2) 衍生方法

准确量取水解后溶液及氨基酸标准品200μL,分别置于1.5mL离心管中,往每支离心管中准确加入正亮氨酸内标50μL,然后分别加入三乙胺乙腈溶液100μL和异硫氰酸苯酯乙腈溶液100μL,摇匀室温静置衍生1小时。衍生结束后分别加入400μL正己烷,振摇并静置10min,取下层溶液200μL并用水稀释到1mL,混合均匀后用0.45μm针式过滤器过滤即可。

(3) 检测方法

3.1 溶液配制

流动相A:称取15.2g无水乙酸钠,加水1850mL,溶解后用冰醋酸调pH值到6.5,然后加乙腈溶液140mL,混合均匀并用0.45μm滤器过滤流动相B:80%乙腈水溶液

3.2 高效液相检测条件

仪器: APS80-16A高效液相色谱仪

色谱柱:APS氨基酸分析专用柱4.6×250mm,5μm,100Å

流 速:1mL/min;进样量:10μL

检测波长:254nm;柱 温:40℃

检测梯度如表1

时间

流动相A

流动相B

0

100

0

2

100

0

15

90

10

25

70

30

33

55

45

33.1

0

100

38

0

100

38.1

100

0

45

100

0

(4) 实验结果与讨论

4.1 液相条件的建立

样品中氨基酸含量比较低,而且直接检测溶剂效应较大,经过衍生后直接检测样品中的氨基酸不能完全分离,本文通过用水稀释衍生溶液的方法降低检测中的溶剂效应,并且经过优化流动相梯度使18种氨基酸得到良好的分离。

但是实际检测过程中相同的检测条件下,仪器不同,分离效果差别较大,有的甚至都完全分不开,为此本文还开发了一种基础检测条件,可以根据仪器的自身特点,稍加调整流动相的比例即可使18种氨基酸得到较好的分离。

基础检测条件如表2所示。

表2 流动相基础梯度变化表:

时间

流动相A

流动相B

0

100

0

15

92

8

25

78

22

36

64

36

38

0

100

43

0

100

43.1

100

0

50

100

0

4.2 检测方法的稳定性、线性及准确性

氨基酸标准品按照2方法衍生后,相同的条件下连续重复进样6次,计算相对标准偏差,结果如表3所示。由结果可知该方法比较稳定,可以用来检测氨基酸样品,其实验谱图如图1所示。

根据仪器对各个物质的响应情况,将氨基酸标准溶液分别稀释成2.5μmol/mL(胱氨酸为1.25μmol/mL)、1.25μmol/mL(胱氨酸为0.625μmol/mL)、0.5μmol/mL(胱氨酸为0.25μmol/mL)、0.25μmol/mL(胱氨酸为0.125μmol/mL)、0.125μmol/mL(胱氨酸为0.0625μmol/mL)5个浓度,然后按照2的衍生方法同时衍生处理,样品经稀释过滤后在相同的实验条件下进样,依据进样浓度X(μmol/mL)为横坐标,峰面积Y为纵坐标进行线性回归,根据各个物质峰高、噪音,遵循S/N=3计算出最低检出限,回归方程及检出限见表3。可见,在选定的液相色谱条件下氨基酸标准溶液的响应与浓度呈良好的线性关系。

表3 氨基酸的线性回归方程、标准偏差和检出限:

名称

线性回归方程

相关系数r2

峰面积RSD6

时间RSD6

检出限(μmol/mL)

门冬氨酸

Y=405.5x

0.9974

0.34%

0.06%

0.025

谷氨酸

Y=401.1x+35.8

0.9965

0.38%

0.14%

0.034

丝氨酸

Y=503.2x+25.5

0.999

0.47%

0.10%

0.039

甘氨酸

Y=689.0x-29.2

0.9997

0.35%

0.09%

0.03

组氨酸

Y=581.2x+1.40

0.9999

0.33%

0.10%

0.034

精氨酸

Y=542.0x+14.5

0.9996

0.28%

0.10%

0.038

苏氨酸

Y=441.8x+29.6

0.9987

0.10%

0.07%

0.047

丙氨酸

Y=753.6x-22.9

0.9998

0.19%

0.07%

0.04

脯氨酸

Y=563.9x-6.20

0.9992

0.29%

0.05%

0.028

酪氨酸

Y=0.0016x-0.0034

1

0.11%

0.04%

0.02

缬氨酸

Y=0.0015x+0.0075

1

0.22%

0.02%

0.021

甲硫氨酸

Y=0.0014+0.0325

0.9999

0.60%

0.02%

0.022

胱氨酸

Y=9.344x-1185

0.6984

16.80%

0.03%

0.043

异亮氨酸

Y=0.0014x-0.024

0.9995

0.20%

0.02%

0.019

亮氨酸

Y=0.0014x+0.0211

0.9999

0.56%

0.01%

0.019

正亮氨酸

-

-

0.43%

0.01%

-

苯丙氨酸

Y=0.0013x+0.0038

1

0.47%

0.01%

0.018

赖氨酸

Y=0.0008x+0.024

1

0.27%

0.01%

0.011

 

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