高效液相色谱仪中色谱分离条件的等强度洗脱和梯度洗脱的优化图示法

发布日期:2018-11-10 09:06 字号:

在高效液相色谱法中,使用具有恒定溶剂组成的等强度流动相洗脱时,可由溶剂选择性三角形组成二元溶剂、三元溶剂和四元溶剂的流动相,它们都具有恒定的溶剂强度,流动相组成的变化仅改变对样品组分的选择性。
    在梯度洗脱中,通常多注重溶剂组成改变时对样品组分选择性的影响。但也应看到在梯度洗脱过程中流动相的溶剂强度也在改变。
格拉基(Glajch J.L.)和柯克兰(Kirkland J.J.)对不同情况的洗脱进行了分类,如表6 - 3- 3 所示。
 
表6-3-3  流动相洗脱系统分类(http://www.chemalink.net/books/C/606/0.html)
 
    图6-3-19表示了在反相液相色谱中表6-3-3 中四种洗脱体系的洗脱情况。
    图6-3-19 中(a)表示简卑等强度洗脱(Simple isocratic,SI)时溶剂组成φ/% - 时间图。此法是最基本的,在色谱运行过程,流动相组成不改变,它可用单一溶剂或混合溶剂(其对应溶剂三角形面上的任何一点)来实现。此图中三角形的中心点,其组成设定为20%MeOH,16.8%CH3CN,11.8%THF 和51.4%H2O,借助混合液设计实验法,可用来方便地优化任何真实的混合物的分离。反相色谱中C(B 作为流动相主体;MeOH、CH3CN、THF 作为改性剂,在指定分离中改变它们的比例可获得最好的选择性。
    图6-3-19中(b)表示等强度多溶剂程序洗脱(isocratic multi - solvent programming,IMP)。
虽然在此情况下同样保持溶剂强度在全部分离中不改变,但是在色谱运行中借助流动相组成的连续或分步变化,使分离选择性获得改善。在对应的溶剂三角形中溶剂组成顺序由% 变到2 的过程,混合物中的各组分获得完全分离,而对应%,(,$ 点的溶剂组成都不能将混合物的各组分分离开。
    图 6 - 3 - 19中(c)表示等选择性多溶剂梯度洗脱(isoselective multisolventgradientlelution,IMGE)。到现在为止,典型的梯度洗脱分离,皆以此方式完成,依据选择性来看它相似于简单等度洗脱。此时改性剂的选择性和它们的相对组成,在色谱运行中并未改变,此时表达溶剂选择性的平面三角形用一个立体三棱镜图形取代。然而在运行过程中流动相主体(H2O)的比例减小,而有机改性剂(MeOH、CH3CN、THF)的比例却在增加,其结果使溶剂强度发生改变。由有机改性剂组成线的相近斜率指明,当梯度洗脱分离时,为保持恒定的选择性,溶剂强度以线性方式在连续减小。
    此情况表明使用由“四元”溶剂组成的流动相进行优化,可以在一个包括广范围k'值混合物的梯度洗脱中,对所有的组分峰提供最好的分离度。
    图6-3-19(d)表示选择性多溶剂梯度洗脱(Selective multi -Solvent gradient elution,
SMGE)。此时表明在色谱运行过程,溶剂的强度、选择性和组成皆在改变。在分离过程中依据选择性的变化,SMGE梯度洗脱相似于IMP程序洗脱,由于运行过程中溶剂强度同样改变,因此SMGE系统表现出要比IMP系统具有更强的分离潜力。此事实在实际分离中特别重要。在梯度洗脱过程,当刚开始溶剂梯度时,流动相的溶剂强度低,k'值高的溶质在色谱柱中无明显的移动。此时低溶剂强度的流动相对洗脱k'值低的色谱峰是适用的,而具有高k'值的组分,不受流动相的影响仍保留在色谱柱入口处,随着流动相溶剂强度的连续或分步增加,高k'值组分逐渐被洗脱出,选择性在不断改变,最终使具有不同k'值组分的分离获得优化结果。图6-3-19(d)表明当流动相的强度和选择性二者同时变化时,在溶剂组成时间图中会出现多个非线性的图线。
    应当指出在SI、IMP、IMGE,-体系中,当选择性或强度改变时,所有溶剂组成变化是线性的,而在SMGE体系中,当溶剂选择性和强度同时改变时,溶剂组成的变化呈现非线性。对许多分离问题,非线性变化,包括分步函数,对优化是更有利的。
    由前述对流动相洗脱系统分类可以看到等强度洗脱可用溶剂选择性平面三角形表示,梯度洗脱可用立体三棱镜图或锥形四面体图来表示。
    用三棱镜图表示一个四元溶剂的梯度洗脱体系(图6-3-20),三棱镜的各个端点皆表示二元溶剂体系,三棱镜的三个侧面及所有的边皆表示三元溶剂体系,三棱镜前后两个三角形端面皆表示四元溶剂体系。若已知MeOH、CH3CN,THF和 H2O 的溶剂极性参数P'分别为5.1,5.8,4.0 和10.2.。则三棱镜前端面三角形中1,2,3,7 点的溶剂组成和溶剂极性参数 P'分别为:
        
    由上述计算可以看出,当进行梯度洗脱时,随MeOH、CH3CN、THF 体积分数的增加,对由7点变至7'点的四元溶剂体系,其所含 H2O 的体积分数由54.8%减少至27.8%,体系的溶剂强度参数P'由7.87 降至6.49。在此色谱运行过程,可获得样品中多元组分的满意分离结果。
    四元溶剂的梯度洗脱体系还可用一个锥形四面体图表示。
    例如,图6-3-21 所示由,H2O、MeOH、CH3CN 和THF 组成的四元溶剂梯度洗脱体系,H2O放在锥形四面体的顶点,三种有机改性剂MeOH,CH3CN 和THF位于底面三角形的三个顶点。四元溶剂体系的溶剂强度沿锥形四面体顶点至底面三角形的方向,随体系中含水量的减小而逐渐降低。在锥形四面体的任意截面上相交的三角形,表示一种等度洗脱的情况。图6-3-22 表示四元溶剂体系从锥形四面体的一个等高面转移到另一个等高面时,进行的梯度洗脱情况。在两个等高面上标志点对应的流动相组成情况见表6-3-4。
 
表6-3-4  图6-3-22 所表示梯度洗脱中标志点对应的流动相组成(http://www.chemalink.net/books/C/607/0.html)

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